its序列鉴定真菌的原理(ITS序列)

“ 话不多说,直接开始今天的主题——给大家梳理一下如何通过测序得到的序列获得最后呈现给读者的系统发育树!”

1、序列准备:

通过测序获得需要鉴定的目标菌株的序列信息,一般细菌测16S rDNA(全长大约1.5 kb左右),真菌测ITS序列(500-750 bp)。

2、将序列上传至NCBI数据库与已知菌种序列进行比较:

以细菌的16S rDNA序列为例(需要FASTA格式):

its序列鉴定真菌的原理(ITS序列) 

1)打开NCBI官网(
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),点击右侧的BLAST,选择Nucleotide BLAST,进入比对页面:(16S rDNA序列比较也可以通过EzBioCloud(
https://www.ezbiocloud.net/)数据库进行比对)

its序列鉴定真菌的原理(ITS序列) 

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2)在blastn选项下面粘贴入比对的序列(粘贴的序列中间不能有空格),其他选项见下图:

its序列鉴定真菌的原理(ITS序列) 

3)点击BLAST进行序列比对(需要一定时间,页面隔几秒刷新一次);

its序列鉴定真菌的原理(ITS序列) 

3、根据比对结果筛选并下载10-12条比对序列:

1)结果页面包含了图中所示的要素,我们可以根据相似度及评分、序列长短筛选我们想要的序列:

its序列鉴定真菌的原理(ITS序列) 

2)筛选规则:与我们提交序列相似度最高的一条或多条16S序列即是我们所提交序列的匹配结果(菌种鉴定时,16S序列比对结果在属水平上具有说服力,所以会显示有多个同属但是不同种的结果,这说明我们的菌种属于该属,至于是什么种还需要通过功能基因进行进一步鉴定)。由于我们提交的序列全长为1500 bp左右,所以筛选过程中尽量选择与之长短相差不大的模式菌株序列,实在找不到与之长度相当的,尽可能选择全基因组序列,数量在10-13条左右(一条相似度大于98.6%的以及其他相似度小于98.6%的),且相似度最好不要集中在很小的一个范围内(太集中作图效果会大大折扣)。

3)选中序列后下载FASTA格式的txt文档就行。

its序列鉴定真菌的原理(ITS序列) 

4、利用MEGA软件进行多序列比对:(大家自行去官网或其他途径下载即可,任何版本都可以)

1)数据整理:将我们自己的序列和下载的序列整理到一起,然后在下载一条与比对结果显示的属属于同一科的远缘属加入到其中作为外群;

2)打开MEGA软件,点击Align,选择Create a new alignment,点击OK,然后根据需要选择核酸(DNA)或者氨基酸(Protein),然后在弹出的的窗口中直接复制粘贴准备好的序列,也可以选择lnsert Sequence From File,选择序列文件(可多选)。序列文件加载之后呈蓝色背景(选中状态),点击W选择Align DNA(核酸序列)或者Align protein(氨基酸序列),在弹出的窗口中设置参数(一般默认即可,无需修改),点击OK,开始序列比对。

its序列鉴定真菌的原理(ITS序列) 

its序列鉴定真菌的原理(ITS序列) 

3)比对完成后,需要截齐两端含有*的序列,选中无*的或者上面是—序列,按Delete删除即可,截齐之后保存文件为:filename.mas。

its序列鉴定真菌的原理(ITS序列) 

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5、构建系统发育树:

多序列比对窗口点击Data,选择Phylogenetic Analysis,弹出窗口询问:所有序列是否编译蛋白质,根据实际情况选择Yes或No。

its序列鉴定真菌的原理(ITS序列) 

此时,返回MEGA主界面进行系统发育树的构建。MEGA主界面点击Phylogeny,选择Construct/Test Neighbor-Joining Tree,弹出的对话框询问:是否使用当前激活的数据,选择Yes。这时弹出建树参数设置对话框,根据实际需要设置即可(参数见下图),然后点击Compute,完成建树弹出建好的系统发育树。

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6、发育树美化:

得到系统发育树后,我们可以将其复制粘贴至word或者PPT进行美化,可以得到如下效果图:

its序列鉴定真菌的原理(ITS序列) 

当然,您也可以通过软件FigTree进行美化,或者在线网站ITOL、EvolView进行发育树的美化。

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